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关于结核分枝杆菌标准株H37Rv mazEF3 基因过表达菌株的研究
专栏：毕业论文
发布日期：2019-07-29
阅读量：1801
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结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB) 感染引起的慢性传染病，是一个严重的公共卫生问题。
结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB) 感染引起的慢性传染病，是一个严重的公共卫生问题。结核病发病人数始终位居甲、乙两类传染病前列，每年死亡人数超过200 万。随着人口流动性的增加、MTB 耐药率的增加、艾滋病等免疫缺陷疾病日益增多，结核病，这一古老的疾病有死灰复燃之势。毒素- 抗毒素系统(toxin-antitoxin system，TAS)广泛存在于各种原核生物，结核分枝杆菌标准株H37Rv 上有38 个可能是毒素- 抗毒素的位点。典型的TAS 是共表达的两个基因组成，一个是编码稳定的毒素蛋白，另一个编码不稳定的抗毒素蛋白。TA系统最初被发现存在于低拷贝的质粒中，随后的研究表明，其也存在于染色体上，但对其是否来源于质粒，还很难判断。
控制结核病的耐药性、复发性依然是疫情防控的重要手段之一，而持留性是其产生的重要原因，结核分枝杆菌的TA 系统被认为与其持留性及潜伏感染相关。因此对结核分枝杆菌的TA 系统功能的研究有望为新型抗结核药提供新靶点。本研究通过构建及初步鉴定结核分枝杆菌毒素- 抗毒素系统中mazEF3 基因的过表达菌株，为进一步研究结核分枝杆菌毒素- 抗毒素系统的生物学作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
结核分枝杆菌标准株H37Rv、大肠杆菌E.coliDH-5ɑ、大肠杆菌- 结核分枝杆菌穿梭载体pMV361均由本实验保存。
1.1.2 主要试剂
pMD-19T、T4 DNA 连接酶购自TaKaRa 公司;SYBR 酶(ABI 公司)，7H9 粉末、OADC(BD 公司)，限制性内切酶EcoRI/HindIII 购自Fermentas 生物技术有限公司;2×Taq PCR MasterMix、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA 聚合酶购自北京天根生物公司、Marker ( Thermo 公司的SM0331、Tiangen 公司的Marker II)。LB 培养基由本实验室自配(胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，氯化钠1 g，蒸馏水定容至100 mL)。引物合成及DNA 测序由上海生物工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 结核分枝杆菌标准株H37Rv DNA 的提取用接种环将结核分枝杆菌标准株H37Rv 接种至酸性改良罗氏培养基上，37 ℃温箱孵育3 周，取对数生长期的结核分枝杆菌，用细菌DNA 提取试剂盒(Tiangen 公司) 提取DNA，进行DNA 凝胶电泳鉴定及利用紫外分光光度计检测DNA 浓度及纯度。
1.2.2 设计引物
本研究参照GenBank 中mazEF3 基因序列，使用Primer Premier 5.0 软件设计引物， 送上海生工合成，序列如下：F-CAGACGAATTCTGTAGACCTATGCCACCAC;R-TGATAAGCTTGACCATACTTCTGAATGTAC。
1.2.3 目的片段扩增
用PCR 扩增H37Rv 的mazEF3 基因，反应体系：50μL，DNA 模板2 μL，上游引物2 μL，下游引物2μL，dNTP 1 μL(25 mmol/L each)，10× pfu Buffer 5μL，Pfu 0.4 μL (5u/μL)，ddH2O 补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 预变性3 min，94 ℃ 变性30 s，58℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，35 个循环;72 ℃继续延伸6 min。扩增产物用凝胶电泳初次鉴定，用DNA回收试剂盒回收、纯化凝胶中的mazEF3 片段，回收方法按试剂盒中步骤进行。
1.2.4 PCR 纯化产物与载体的双酶切
PCR 产物的酶切，反应体系为PCR 产物20 μL，EcoRI 1 μL (10u/μL)，HindIII 1 μL(10μ/μL)，FD Buffer 5 μL，ddH2O 补足至50 μL。载体酶切，pMV361 1.5 μg，EcoRI 1 μL (10μ/μL)，HindIII 1μL (10μ/μL)，FD Buffer 10 μL，ddH2O 补足至50μL。将以上体系均放入37 ℃恒温水浴锅中反应3h，电泳回收目的条带。
1.2.5 目的片段与载体连接
连接体系20 μL，PCR 产物双酶切的目的片段6 μL (50 ng)，双酶切的pMV361 目的片段1 μL(100 ng)，10 ×T4 DNAligase Buffer 2 μL，T4DNAligase 1 μL (5u/μL)，ddH2O 补足至20 μL。以上体系放入22 ℃恒温水浴锅中反应3 h。
1.2.6 转化、筛选克隆
取出-80 ℃冰箱中的DH5a，并制备成DH5a 的感受态细胞。将连接液加入到DH5a 的感受态细胞中，冰上孵育30 min，然后42 ℃水浴90 s，继续冰上孵育10 min，加入1 mL 不含抗生素的LB 液体培养基，180 r/min 37 ℃水平摇床45 min，3000r/min 离心20 s，倒掉部分上清液，留取200 μL 即可，重悬菌体，然后涂布到含有0.05 g/L kanamycin的LB 平板上。挑取单菌落，提取DH5a 菌内重组质粒，经过PCR 及双酶切鉴定，得到重组质粒的目的基因片段，并将PCR 扩增目的片段及酶切小片段送上海生物工程有限公司测序。结果显示质粒中成功插入了mazEF3 基因，由此可知，成功构建了重组穿梭质粒pMV361-mazEF3。
1.2.7 H37Rv 过表达菌株的构建
用22SWG 标准接种环刮取对数期的H37Rv 置于含玻璃珠的无菌EP 管中破细菌膜，水平震荡仪中震荡30 min， 制成菌悬液移入EP 管中， 冰浴30min，4 ℃ 8000 rpm/min，离心10 min，弃上清，将菌体重悬于10%预冷甘油中，与标准麦氏比浊管比对，调成1×108/mL菌悬液，成为H37Rv 的感受态形式。
设置9 个平行组，不同电压条件下构建过表达菌株， 电压分别为1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600 V， 每组操作均如下， 取2μL 重组表达质粒pMV361-mazEF3 和200μLH37Rv 感受态混匀，冰浴20 min，移入电击杯底部，用不同的预定电压电击一次，然后移入7H9 培养基中，37 ℃摇床过夜，取30 μL涂到含卡那霉素的罗氏培养基上，37 ℃培养孵育，同时接种正常的H37Rv 作为对照，因电击对细菌损伤较大，菌体生长缓慢，0~5 周检测细菌生长情况，并传15 代。
1.2.8 过表达菌株重组质粒的mazEF3 基因鉴定取构建的过表达菌株的第一代菌体、转接后的第二代、第三代菌体，第十五代菌均用质粒提取试剂盒提取质粒，以此为模板，PCR 扩增重组质粒的mazEF3 基因，鉴定扩增产物，EcoRI、HindIII 限制性双酶切所提取质粒，得到大小2 个片段，将其中目的基因片段送上海生物工程有限公司测序。
1.2.9 检测过表达菌株生长情况
用22SWG 标准接种环，挑取含卡那霉素的罗氏培养基上生长的菌落。用标准麦氏比浊管比对，均调成1×106/mL菌悬液，分别移入10 mL 7H9 液体培养基的试管中，37 ℃恒温摇床150 r/min 培养。根据结核分枝杆菌生长特点，设定了10 个时间观测点，分别为接菌后的第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天，观测其不同时间点的菌浓度，并绘制生长曲线。
1.2.10 实时荧光定量检测mazEF3 mRNA表达水平
用细菌RNA 提取试剂盒(RNeasy Plus UniversalMidi Kit)提取细菌总RNA，为减少RNA 降解，离心机温度设定为4 ℃，所有操作在冰袋上进行，并根据核酸蛋白检测仪检测D260/280 紫外吸收率，确定RNA 纯度，琼脂糖凝胶电泳观察其完整性。按照试剂盒(TIANScript RT Kit-TIANScript cDNA 第一链合成试剂盒)说明书，逐步逆转录合成cDNA。实时荧光定量检测不同电压转化条件下及对照组H37Rv菌株的表达量。
2 结果与分析
2.1 原始目的基因片段的获得
用设计好的上、下游引物，以H37Rv 的DNA 为模板， 进行PCR 扩增H37RvmazEF3 基因，得到大小为600-700 bp 的片段，与已知的mazEF3 基因片段大小(667 bp)一致。
2.2 PCR 及双酶切鉴定构建的质粒mazEF3 基因
以提取的过表达菌株中的重组质粒为模板，PCR 扩增出目的条带，大小约670 bp， 与已知H37Rv 的mazEF3 基因大小(667 bp)相符。用EcoRI 和HindIII 限制性内切酶双酶切质粒，获得2个片段，1 个大片段，1 个小片段。琼脂糖凝胶电泳显示，小片段为目的片段，大小约670 bp，另1 个是质粒片段，大小约为4500 bp。将构建的结核分枝杆菌过表达菌株的第2 代、3 代、15 代，分别提取重组质粒，均可以得到目的片段，说明此方法构建的过表达菌株具有遗传的稳定性。将PCR、双酶切得到的目的片段送上海生物工程有限公司进行序列测定，用DNAman 软件将测序结果和GeneBank 中的序列进行比对，结果显示两者的核苷酸同源性为100%。这说明在重组过表达质粒pMV361-mazEF3 基础上，构建的过表达菌株成功。
2.3 不同菌株的菌落形态观察
在含100 μg/mL 卡那霉素的培养基上，1800-2100V 和2600V 电转的没有菌落的生长，电转在2200-2500V 条件下的过表达菌株生长良好，观察菌落大小、形态、色泽、隆起程度、致密度、边缘无明显差异。对照组H37Rv 在卡那霉素培养基中没有观察到菌落的生长。
2.4 液体培养基中两种菌株生长情况的观测
根据结核分枝杆菌生长特点，设定了10 个时间观测点，分别为接菌后的第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 天，观测其不同时间点的菌浓度。mazEF3 过表达菌株的OD600 分别为0、0.02、0.14、0.3、0.6、1.1、1.6、1.63、1.76、1.62、1.51; 对照组H37RV 的OD600 分别为0、0.052、0.27、0.562、0.839、1.317、1.602、1.627、1.759、1.784、1.785 并绘制生长曲线。
2.5 不同电转条件下mazEF3 表达量
荧光定量PCR 检测过表达组和正常H37Rv 对照组的mRNA 表达量，在电转电压为1800、1900、2000、2100 及2600 V 时，未检测到mazEF3 的mRNA 表达，其他电压下ΔCt 值(+S 表示)。检测过表达菌的变化量=2-ΔΔct(ΔΔCt=ΔCt 过表达菌-ΔCt 正常的H37Rv)，与正常H37Rv 对照组相比，2200V 的表达量上调了6.24 倍，2300V 构建的过表达菌上调了16.78 倍，2400V 的过表达菌上调了11.11 倍，2500V 的过表达菌株上调了2.56 倍.
3 讨论
结核分枝杆菌H37Rv 的测序工作已经在1998年完成，但大量基因功能尚未阐明。把目的基因敲除和过表达是基因功能研究的基本方法，快速高效的构建方法将大大增加基因研究的效率。本实验通过重组pMV361-mazEF3 质粒，并将该重组表达质粒导入H37Rv 中，实现了mazEF3 mRNA 在结核分枝杆菌中的稳定表达。电转化是利用高电压脉冲使细胞膜产生瞬间可逆性裂隙，质粒从而有机会进入菌体的原理。相对于化学方法，电转化法可以获得更高的转化效率，重复性较好，导入效率高。pMV361-mazEF3 的mazEF3 mRNA 在结核分枝杆菌中稳定表达，同时对载体菌自身无影响，且具有卡那霉素抗性片段，提供了一个筛选标志，是研究结核分枝杆菌基因过表达较理想的载体质粒。
毒素- 抗毒素系统，在1982 年低拷贝质粒中首次被发现，随后发现也存在于细菌染色体上，还存在于细菌的外源DNA 岛如噬菌体、转座子等。目前已经发现的TA 系统主要分为9 个家族， 分别是ccd AB、par DE、maz EF、rel BE、phd/doc、vap BC、Hip BA、hig BA 和ω-ε-ξ。MazEF 系统是在大肠杆菌染色体发现的第一个TA 系统。TA 系统的毒素成分单一，均为蛋白质，但是抗毒素成分多样，可以是反义的mRNA，可以是抗毒素基因表达的蛋白质。MazEF 系统对细菌的生长调解起到重要作用，与细胞的程序性死亡，持留性有关，细菌在环境不利的条件下，形成持留状态，提高菌体对周围环境的适应性。
具有mazEF 系统的大肠埃希氏菌，比缺失突变株中的菌体更耐受氨基酸饥饿、紫外线照射、高温、高渗等不利条件，更耐受应活性氧、过氧化氢的刺激。对TA 系统的作用，目前还存在争议，从单个菌体来看，mazEF 系统不利于个体的生存，但在遭遇恶劣生存环境时，mazEF 系统介导的死亡被认为是一种“利他”行为，营养条件不足以支撑整个菌群时，一部分细菌的程序性死亡，可以保证小部分细菌的存活，防止整个菌落的灭亡。mazEF 系统选择性凋亡在发展新型抗菌药物方面具有极好的前景，如果将其原理应用在细菌药物的研发，将有可能选择性清除细菌，无副作用产生，为防控治病菌提供了新靶点。
本研究观察了9 组不同电转条件下，mazEF3mRNA 的分子水平表达量，以确定最佳的转化电压。在电转电压为1800V-2100V 时电转不成功，可能因为电压过低，很难极化产生孔洞，电转电压为2300V时，mazEF3 mRNA 的表达量最高。但是电压超过2300V，随着电转电压的增加，表达量是减少的，到2600V 电转的过表达菌株并未构建成功，说明过高的电压使结核分枝杆菌损伤过大而造成菌株的死亡，并不能增加转化效率。
通过生长曲线，我们可以观察到过表达菌株在接菌后的20 d 内生长速度明显慢于对照组的H37RV，到达平台期后，两组的菌量基本持平。但是过了26 天，mazEF3 过表达组菌株的凋亡速度明显快于对照组的H37RV，可能随着营养成分的耗尽、代谢废物的增加，不利的生存环境的条件下，mazEF系统介导的自身凋亡体制被启动。
目前，对mazEF 系统功能的研究，主要集中在大肠埃希氏菌等革兰阴性菌。对于结核分枝杆菌中的mazEF 系统的功能，是否也参与着生长调控、是否参与着结核分枝杆菌传播及宿主细胞内寄生，菌体自身代谢的调整，有待进一步研究。我们运用相同的方法，随后也构建出mazEF6、mazEF9 的过表达菌株，因方法相同，不再赘述。mazEF3、mazEF6、mazEF9过表达菌株的成功构建为进一步研究结核分枝杆菌mazEF 系统的功能奠定了基础。
控制结核病的耐药性、复发性依然是疫情防控的重要手段之一，而持留性是其产生的重要原因，结核分枝杆菌的TA 系统被认为与其持留性及潜伏感染相关。因此对结核分枝杆菌的TA 系统功能的研究有望为新型抗结核药提供新靶点。本研究通过构建及初步鉴定结核分枝杆菌毒素- 抗毒素系统中mazEF3 基因的过表达菌株，为进一步研究结核分枝杆菌毒素- 抗毒素系统的生物学作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
结核分枝杆菌标准株H37Rv、大肠杆菌E.coliDH-5ɑ、大肠杆菌- 结核分枝杆菌穿梭载体pMV361均由本实验保存。
1.1.2 主要试剂
pMD-19T、T4 DNA 连接酶购自TaKaRa 公司;SYBR 酶(ABI 公司)，7H9 粉末、OADC(BD 公司)，限制性内切酶EcoRI/HindIII 购自Fermentas 生物技术有限公司;2×Taq PCR MasterMix、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA 聚合酶购自北京天根生物公司、Marker ( Thermo 公司的SM0331、Tiangen 公司的Marker II)。LB 培养基由本实验室自配(胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，氯化钠1 g，蒸馏水定容至100 mL)。引物合成及DNA 测序由上海生物工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 结核分枝杆菌标准株H37Rv DNA 的提取用接种环将结核分枝杆菌标准株H37Rv 接种至酸性改良罗氏培养基上，37 ℃温箱孵育3 周，取对数生长期的结核分枝杆菌，用细菌DNA 提取试剂盒(Tiangen 公司) 提取DNA，进行DNA 凝胶电泳鉴定及利用紫外分光光度计检测DNA 浓度及纯度。
1.2.2 设计引物
本研究参照GenBank 中mazEF3 基因序列，使用Primer Premier 5.0 软件设计引物， 送上海生工合成，序列如下：F-CAGACGAATTCTGTAGACCTATGCCACCAC;R-TGATAAGCTTGACCATACTTCTGAATGTAC。
1.2.3 目的片段扩增
用PCR 扩增H37Rv 的mazEF3 基因，反应体系：50μL，DNA 模板2 μL，上游引物2 μL，下游引物2μL，dNTP 1 μL(25 mmol/L each)，10× pfu Buffer 5μL，Pfu 0.4 μL (5u/μL)，ddH2O 补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 预变性3 min，94 ℃ 变性30 s，58℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，35 个循环;72 ℃继续延伸6 min。扩增产物用凝胶电泳初次鉴定，用DNA回收试剂盒回收、纯化凝胶中的mazEF3 片段，回收方法按试剂盒中步骤进行。
1.2.4 PCR 纯化产物与载体的双酶切
PCR 产物的酶切，反应体系为PCR 产物20 μL，EcoRI 1 μL (10u/μL)，HindIII 1 μL(10μ/μL)，FD Buffer 5 μL，ddH2O 补足至50 μL。载体酶切，pMV361 1.5 μg，EcoRI 1 μL (10μ/μL)，HindIII 1μL (10μ/μL)，FD Buffer 10 μL，ddH2O 补足至50μL。将以上体系均放入37 ℃恒温水浴锅中反应3h，电泳回收目的条带。
1.2.5 目的片段与载体连接
连接体系20 μL，PCR 产物双酶切的目的片段6 μL (50 ng)，双酶切的pMV361 目的片段1 μL(100 ng)，10 ×T4 DNAligase Buffer 2 μL，T4DNAligase 1 μL (5u/μL)，ddH2O 补足至20 μL。以上体系放入22 ℃恒温水浴锅中反应3 h。
1.2.6 转化、筛选克隆
取出-80 ℃冰箱中的DH5a，并制备成DH5a 的感受态细胞。将连接液加入到DH5a 的感受态细胞中，冰上孵育30 min，然后42 ℃水浴90 s，继续冰上孵育10 min，加入1 mL 不含抗生素的LB 液体培养基，180 r/min 37 ℃水平摇床45 min，3000r/min 离心20 s，倒掉部分上清液，留取200 μL 即可，重悬菌体，然后涂布到含有0.05 g/L kanamycin的LB 平板上。挑取单菌落，提取DH5a 菌内重组质粒，经过PCR 及双酶切鉴定，得到重组质粒的目的基因片段，并将PCR 扩增目的片段及酶切小片段送上海生物工程有限公司测序。结果显示质粒中成功插入了mazEF3 基因，由此可知，成功构建了重组穿梭质粒pMV361-mazEF3。
1.2.7 H37Rv 过表达菌株的构建
用22SWG 标准接种环刮取对数期的H37Rv 置于含玻璃珠的无菌EP 管中破细菌膜，水平震荡仪中震荡30 min， 制成菌悬液移入EP 管中， 冰浴30min，4 ℃ 8000 rpm/min，离心10 min，弃上清，将菌体重悬于10%预冷甘油中，与标准麦氏比浊管比对，调成1×108/mL菌悬液，成为H37Rv 的感受态形式。
设置9 个平行组，不同电压条件下构建过表达菌株， 电压分别为1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600 V， 每组操作均如下， 取2μL 重组表达质粒pMV361-mazEF3 和200μLH37Rv 感受态混匀，冰浴20 min，移入电击杯底部，用不同的预定电压电击一次，然后移入7H9 培养基中，37 ℃摇床过夜，取30 μL涂到含卡那霉素的罗氏培养基上，37 ℃培养孵育，同时接种正常的H37Rv 作为对照，因电击对细菌损伤较大，菌体生长缓慢，0~5 周检测细菌生长情况，并传15 代。
1.2.8 过表达菌株重组质粒的mazEF3 基因鉴定取构建的过表达菌株的第一代菌体、转接后的第二代、第三代菌体，第十五代菌均用质粒提取试剂盒提取质粒，以此为模板，PCR 扩增重组质粒的mazEF3 基因，鉴定扩增产物，EcoRI、HindIII 限制性双酶切所提取质粒，得到大小2 个片段，将其中目的基因片段送上海生物工程有限公司测序。
1.2.9 检测过表达菌株生长情况
用22SWG 标准接种环，挑取含卡那霉素的罗氏培养基上生长的菌落。用标准麦氏比浊管比对，均调成1×106/mL菌悬液，分别移入10 mL 7H9 液体培养基的试管中，37 ℃恒温摇床150 r/min 培养。根据结核分枝杆菌生长特点，设定了10 个时间观测点，分别为接菌后的第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天，观测其不同时间点的菌浓度，并绘制生长曲线。
1.2.10 实时荧光定量检测mazEF3 mRNA表达水平
用细菌RNA 提取试剂盒(RNeasy Plus UniversalMidi Kit)提取细菌总RNA，为减少RNA 降解，离心机温度设定为4 ℃，所有操作在冰袋上进行，并根据核酸蛋白检测仪检测D260/280 紫外吸收率，确定RNA 纯度，琼脂糖凝胶电泳观察其完整性。按照试剂盒(TIANScript RT Kit-TIANScript cDNA 第一链合成试剂盒)说明书，逐步逆转录合成cDNA。实时荧光定量检测不同电压转化条件下及对照组H37Rv菌株的表达量。
2 结果与分析
2.1 原始目的基因片段的获得
用设计好的上、下游引物，以H37Rv 的DNA 为模板， 进行PCR 扩增H37RvmazEF3 基因，得到大小为600-700 bp 的片段，与已知的mazEF3 基因片段大小(667 bp)一致。
2.2 PCR 及双酶切鉴定构建的质粒mazEF3 基因
以提取的过表达菌株中的重组质粒为模板，PCR 扩增出目的条带，大小约670 bp， 与已知H37Rv 的mazEF3 基因大小(667 bp)相符。用EcoRI 和HindIII 限制性内切酶双酶切质粒，获得2个片段，1 个大片段，1 个小片段。琼脂糖凝胶电泳显示，小片段为目的片段，大小约670 bp，另1 个是质粒片段，大小约为4500 bp。将构建的结核分枝杆菌过表达菌株的第2 代、3 代、15 代，分别提取重组质粒，均可以得到目的片段，说明此方法构建的过表达菌株具有遗传的稳定性。将PCR、双酶切得到的目的片段送上海生物工程有限公司进行序列测定，用DNAman 软件将测序结果和GeneBank 中的序列进行比对，结果显示两者的核苷酸同源性为100%。这说明在重组过表达质粒pMV361-mazEF3 基础上，构建的过表达菌株成功。
2.3 不同菌株的菌落形态观察
在含100 μg/mL 卡那霉素的培养基上，1800-2100V 和2600V 电转的没有菌落的生长，电转在2200-2500V 条件下的过表达菌株生长良好，观察菌落大小、形态、色泽、隆起程度、致密度、边缘无明显差异。对照组H37Rv 在卡那霉素培养基中没有观察到菌落的生长。
2.4 液体培养基中两种菌株生长情况的观测
根据结核分枝杆菌生长特点，设定了10 个时间观测点，分别为接菌后的第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 天，观测其不同时间点的菌浓度。mazEF3 过表达菌株的OD600 分别为0、0.02、0.14、0.3、0.6、1.1、1.6、1.63、1.76、1.62、1.51; 对照组H37RV 的OD600 分别为0、0.052、0.27、0.562、0.839、1.317、1.602、1.627、1.759、1.784、1.785 并绘制生长曲线。
2.5 不同电转条件下mazEF3 表达量
荧光定量PCR 检测过表达组和正常H37Rv 对照组的mRNA 表达量，在电转电压为1800、1900、2000、2100 及2600 V 时，未检测到mazEF3 的mRNA 表达，其他电压下ΔCt 值(+S 表示)。检测过表达菌的变化量=2-ΔΔct(ΔΔCt=ΔCt 过表达菌-ΔCt 正常的H37Rv)，与正常H37Rv 对照组相比，2200V 的表达量上调了6.24 倍，2300V 构建的过表达菌上调了16.78 倍，2400V 的过表达菌上调了11.11 倍，2500V 的过表达菌株上调了2.56 倍.
3 讨论
结核分枝杆菌H37Rv 的测序工作已经在1998年完成，但大量基因功能尚未阐明。把目的基因敲除和过表达是基因功能研究的基本方法，快速高效的构建方法将大大增加基因研究的效率。本实验通过重组pMV361-mazEF3 质粒，并将该重组表达质粒导入H37Rv 中，实现了mazEF3 mRNA 在结核分枝杆菌中的稳定表达。电转化是利用高电压脉冲使细胞膜产生瞬间可逆性裂隙，质粒从而有机会进入菌体的原理。相对于化学方法，电转化法可以获得更高的转化效率，重复性较好，导入效率高。pMV361-mazEF3 的mazEF3 mRNA 在结核分枝杆菌中稳定表达，同时对载体菌自身无影响，且具有卡那霉素抗性片段，提供了一个筛选标志，是研究结核分枝杆菌基因过表达较理想的载体质粒。
毒素- 抗毒素系统，在1982 年低拷贝质粒中首次被发现，随后发现也存在于细菌染色体上，还存在于细菌的外源DNA 岛如噬菌体、转座子等。目前已经发现的TA 系统主要分为9 个家族， 分别是ccd AB、par DE、maz EF、rel BE、phd/doc、vap BC、Hip BA、hig BA 和ω-ε-ξ。MazEF 系统是在大肠杆菌染色体发现的第一个TA 系统。TA 系统的毒素成分单一，均为蛋白质，但是抗毒素成分多样，可以是反义的mRNA，可以是抗毒素基因表达的蛋白质。MazEF 系统对细菌的生长调解起到重要作用，与细胞的程序性死亡，持留性有关，细菌在环境不利的条件下，形成持留状态，提高菌体对周围环境的适应性。
具有mazEF 系统的大肠埃希氏菌，比缺失突变株中的菌体更耐受氨基酸饥饿、紫外线照射、高温、高渗等不利条件，更耐受应活性氧、过氧化氢的刺激。对TA 系统的作用，目前还存在争议，从单个菌体来看，mazEF 系统不利于个体的生存，但在遭遇恶劣生存环境时，mazEF 系统介导的死亡被认为是一种“利他”行为，营养条件不足以支撑整个菌群时，一部分细菌的程序性死亡，可以保证小部分细菌的存活，防止整个菌落的灭亡。mazEF 系统选择性凋亡在发展新型抗菌药物方面具有极好的前景，如果将其原理应用在细菌药物的研发，将有可能选择性清除细菌，无副作用产生，为防控治病菌提供了新靶点。
本研究观察了9 组不同电转条件下，mazEF3mRNA 的分子水平表达量，以确定最佳的转化电压。在电转电压为1800V-2100V 时电转不成功，可能因为电压过低，很难极化产生孔洞，电转电压为2300V时，mazEF3 mRNA 的表达量最高。但是电压超过2300V，随着电转电压的增加，表达量是减少的，到2600V 电转的过表达菌株并未构建成功，说明过高的电压使结核分枝杆菌损伤过大而造成菌株的死亡，并不能增加转化效率。
通过生长曲线，我们可以观察到过表达菌株在接菌后的20 d 内生长速度明显慢于对照组的H37RV，到达平台期后，两组的菌量基本持平。但是过了26 天，mazEF3 过表达组菌株的凋亡速度明显快于对照组的H37RV，可能随着营养成分的耗尽、代谢废物的增加，不利的生存环境的条件下，mazEF系统介导的自身凋亡体制被启动。
目前，对mazEF 系统功能的研究，主要集中在大肠埃希氏菌等革兰阴性菌。对于结核分枝杆菌中的mazEF 系统的功能，是否也参与着生长调控、是否参与着结核分枝杆菌传播及宿主细胞内寄生，菌体自身代谢的调整，有待进一步研究。我们运用相同的方法，随后也构建出mazEF6、mazEF9 的过表达菌株，因方法相同，不再赘述。mazEF3、mazEF6、mazEF9过表达菌株的成功构建为进一步研究结核分枝杆菌mazEF 系统的功能奠定了基础。
