摘    要：　为了鉴定新鲜香蕉皮中通过分离纯化得到的一株细菌, 本实验采用观察细菌菌落形态特征、生理生化鉴定试验以及16S rDNA基因序列分析等方法对该分离菌进行鉴定.结果表明, 该分离菌为革兰氏阴性菌.此菌不能降解棉子糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、枸橼酸盐等, 但可以降解尿素、甘露糖.经鉴定该菌株属于变形菌门、莫拉菌科、不动杆菌属细菌.该菌种在香蕉皮中的发现丰富了不动杆菌属细菌在环境中的分布, 也为香蕉皮内生菌种的进一步开发和利用奠定了研究基础, 因此本研究工作具有重要的理论意义和潜在的应用价值.

　　关键词：　香焦皮内生菌; 纯化分离; 生化鉴定;

　　Abstract：　In order to identify a strain of bacteria obtained by separation and purification in fresh banana peel, this experiment aimed to identify the isolate this bacteria strain by using the method of observing bacterial colony morphology, physiological and biochemical identification test and 16 S rDNA gene sequence analysis.The results showed that the bacteria was Gram-negative bacteria.It could not degrade raffinose, arabinose, maltose, sucrose, glucose, mannitol, lactose, citrate, etc.But it could degrade urea and mannose.The strain was identified as Proteobacteria, Moraxaceae, and Acinetobacter.The discovery of this species in banana peel enriches the distribution of Acinetobacter bacteria in the environment.It also lays a research foundation for the further development and utilization of endophytic species of banana peel.Therefore, this research work has important theoretical significance and potential application value.

　　Keyword：　Endophyte; Separation; Identification;

　　内生菌是指存活于植物组织内, 但不引发宿主植物出现明显感染症状的微生物类群, 其与宿主存在着和谐的共生关系[1,2,3,4].存在新鲜果皮中的内生菌具有着广阔的研究前景和利用价值.香蕉 (MusananaLour.) 芭蕉科芭蕉属植物, 又指其果实, 热带地区广泛种植.而在我国香蕉已有3000多年的栽培历史[5], 因其气味芬芳, 肉质软而滑腻, 爽口甘甜, 深受人们的喜爱.香蕉被联合国粮农组织 (FAO) 定位为发展中国家仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物.据统计, 2009年农产品贸易中, 香蕉仅次于小麦、大豆和玉米, 位居第4位[6].香蕉中香蕉皮占全果质量的35%～41%[7].生活中, 香蕉皮一般会被使用者直接丢弃, 易造成环境的污染[8].本试验从新鲜香蕉皮中分离纯化一株未知细菌, 并对该菌株进行细菌特征观察、生理生化鉴定及16S rDNA基因序列分析.目前, 对香蕉皮的研究主要是对香蕉皮色素的提取、有效活性物质提取等[9], 而关于香蕉皮内生菌的研究鲜有报道.而本研究为对一株来源于香蕉皮的内生菌进行分离鉴定, 并对其生物活性开展的研究, 具有重要的现实意义和开发利用的潜力, 为香蕉皮内生菌种的开发和利用奠定了研究基础.

　　1 、材料

　　1.1、 实验材料

　　市售新鲜香蕉:香蕉皮表面含有少量黑斑或无黑斑.

　　1.2、 培养基

　　LB固体培养基:胰化蛋白胨10 g, 酵母提取物5 g, NaCl 5 g, 15 g琼脂粉, 摇动容器直至溶质溶解.用5 mol/L NaOH调pH至7.4, 去离子水定容至1 L.加热溶解, 121℃高压灭菌30 min.
 

　　1.3 、试剂

　　硫酸双氢链霉素、青霉素G钾、PCR试剂盒、乳酸石炭酸棉蓝染色液、5%石炭酸水溶液、75%酒精、0.1%升汞等.

　　1.4、 仪器

　　生化培养箱 (ZHWY-200D) 、超净工作台、生物显微镜等.

　　2 、实验方法

　　2.1、 菌种分离及形态学观察

　　选取新鲜香蕉皮, 用无菌水、75%酒精和0.1%升汞处理后, 切成均匀小片, 与果肉接触部分置于含链霉素 (50～100 mg/L) 和青霉素 (100～300 mg/L) 的LB培养基上.于25～35℃黑暗条件下培养, 待平板上长出肉眼可见的菌落时, 采用平板划线的方法分离细菌, 继续培养.连续多代纯化, 即可获得生长优良的菌种, 将所得的纯化菌株接种到斜面上, 4℃冰箱中保存.选择形态特征明显的单一菌落, 观察其形态特征及其生长情况, 并挑取培养基上的菌落进行革兰氏染色, 镜检观察.

　　2.2 、细菌的生理生化鉴定

　　将纯化后的菌株纯培养物进行糖发酵试验、尿素试验、硝酸盐还原试验、枸橼酸盐试验等各项生理生化试验.置于34℃恒温培养24 h, 根据东秀珠等人所着的《常见细菌系统鉴定手册》判定结果.

　　2.3 、细菌的16SrDNA基因序列扩增及其序列分析

　　采用细菌基因组DNA提取试剂盒, 按照革兰氏阴性细菌提取基因组的方法, 提取需鉴定菌株的基因组.按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取目标菌株的基因组DNA, 以其为模板, 利用16S rDNA序列扩增通用引物进行PCR扩增.PCR产物的核酸序列送往兰州领先生物技术有限公司进行测序.测序结果与NCBI中的BLAST程序进行序列同源性比对分析, 选取与分离菌序列相似性高的序列, 利用MEGA5.1软件手动调整序列, 自展数 (bootstrap) 为1 000, 模型Kimura 2-parameter model (K2) , 构建邻接法 (Neighbor-joining, NJ) 系统发育树.

　　3、 结果与分析

　　3.1、 形态学特征

　　经形态学初步鉴定表明, 该菌株为革兰氏阴性, 球杆状, 不运动, 单个或多个排列, 不产芽孢.在LB培养基中34℃培养24小时, 形成圆形、隆起、边缘整齐、表面粗糙、干燥粉末状, 初期呈白色, 后期中间呈墨绿色, 边缘呈白色的菌落, 产黄色素.初步命名为W.

　　3.2、 生理生化特征

　　该细菌的生理生化特征符合不动杆菌的基本特征, 不能降解硝酸盐、淀粉、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、棉子糖、甘露糖, 但可以利用甘露糖、尿素 (见表1) .

　　表1 细菌W生理生化鉴定结果

　　3.3、 16SrDNA基因序列测定结果及系统发育树分析

　　根据相关文章表明[10,11,12,13], 一般16S rDNA序列同源性大于99%, 可以认为是同一个种.16S rDNA序列同源性小于98%, 可以认为不属于同一个种.同源性小于95%, 可以认为不属于同一个属.

　　经鉴定, 细菌W的16S rDNA的1411个核苷酸得到有效的扩增.将细菌W的16S rDNA基因序列进行Blaste比对分析, 发现与GeneBank数据库中的Acinetobacter guillouiae不同菌株16S rDNA序列的相似性高达99%.系统发育树结果显示, 分离菌W与Acinetobacter guillouiae聚为一簇, 亲缘关系最近, 而与其他细菌亲缘关系较远.结合生理生化特征, 可判断分离菌属于不动杆菌属.

　　图1 细菌W的16S rDNA全序列的系统发育树

　　4、 讨论

　　不动杆菌是条件致病菌, 根据相关文章报导[14,15], 其广泛分布于水、土壤、医院环境和人体皮肤表面, 而不同种类的不动杆菌在外界的分布情况, 到目前为止还没有系统的研究.据相关报导[16,17], 在43%健康个体的皮肤上可分离到不动杆菌, 也可在健康成年人的口腔及呼吸道分离得到.所以它已成为医院获得性感染的主要致病菌之一, 因此如何治疗不动杆菌引起的感染已成为临床关注的重点.近年来, 还发现某些不动杆菌还具有降解多环芳烃的作用, 所以, 不动杆菌在石油污染的环境治理中有着良好的研究价值, 在石油烃降解方面具有良好的应用前景.

　　到目前为止, 鲜有关于从香蕉皮中分离得到不动杆菌属细菌的报导, 而本研究从新鲜香蕉皮中分离纯化获得一株内生菌, 并对该菌进行形态特征观察、生理生化鉴定试验以及16S rDNA基因序列的分析, 确定了该菌为不动杆菌属细菌.该菌种在香蕉皮中的发现丰富了不动杆菌属细菌的分布, 也为香蕉皮内生菌种的进一步开发和利用奠定了研究基础, 因此本研究工作具有重要的理论意义和潜在的应用价值.

　　5、 结论

　　本研究从新鲜香蕉皮中分离出未知菌W, 对其进行了13项生理生化试验, 反应结果与不动杆菌属细菌生理生化指标相似.对该菌株的16S rDNA基因序列进行测序分析, 通过Blaste与GenBank中相关数据比对以及利用MEGA5.1软件构建系统发育树, 分析结果表明, 该菌株与Acinetobacter guillouiae的相似性最高, 因此判断该菌株W为不动杆菌属细菌.

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